ПЦР: метод диагностики половых инфекций

Полимеразная цепная реакция – что это такое, какие заболевания выявляет, в чем преимущества и недостатки анализа и что значат его результаты – в материале РИА Новости.

Анализ ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. В его основе лежит многократное увеличение малых концентраций фрагментов РНК и ДНК. Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом.

Он хотел добиться того, чтобы можно было создать множество копий ДНК за счет фермента ДНК-полимеразы, который участвует в ее репликации. За это Муллис получил Нобелевскую премию по химии. Известно, что еще в начале 1970-х годов похожий метод был представлен другим ученым, однако задумку так и не смогли реализовать.

Позже анализ был значительно усовершенствован и широко используется в биологической, биохимической и медицинской практике.

Как работает ПЦР

Для проведения анализа необходимо сложное, современное оборудование.

ПЦР: метод диагностики половых инфекций

«Применяется специальный прибор, он называется амплификатор, в который помещается частица вируса или еще что-нибудь, содержащее РНК или ДНК, – рассказал РИА Новости кандидат медицинских наук, клинический фармаколог Андрей Кондрахин. – Дело в том, что РНК и ДНК достаточно маленькие, чтобы их определить, и понять есть ли в теле человека вредоносные микроорганизмы, поэтому делают ПЦР-тест.

В большую машину кладут частичку вируса, но она его не распознает, затем добавляются специальные компоненты, праймеры, которые позволяют сделать большое количество этих цепочек РНК. Их становится так много, что машина начинает их «видеть».

Даже если есть хоть самая маленькая РНК вируса, например, коронавируса, это позволяет создать множество копий инфекции, что помогает определить, присутствует она в организме или нет. Метод дает результат практически стопроцентной точности. Для определения COVID-19 есть отдельный праймер. Там находится большое число нуклеотидов, из которых строится будущая РНК.

Она сначала разрушается, а потом заново выстраивается. Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание».

Применение ПЦР

ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими.

«Метод применяется не только для вирусов, но и частичек ДНК, а также бактерий, – пояснил специалист. – Например, мы можем определить, к какому виду бактерия относится, например, к грамотрицательным или грамположительным».

Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности.

Проведение ПЦР

Для анализа требуется ДНК- или РНК-матрицы, участки которых нужно скопировать, два праймера с необходимыми ферментами, термостабильная ДНК-полимераза, а также некоторые другие компоненты. Метод ПЦР выявляет любую ДНК или РНК живого или мертвого возбудителя. Для их определения используют особые праймеры, в которых содержатся вырожденные позиции РНК или ДНК.

ПЦР: метод диагностики половых инфекций

Подготовка материала

Этот этап чрезвычайно важен для проведения анализа ПЦР, потому что большинство ошибок, до 70% случаев, совершается именно во время пробоподготовки, что влияет на конечный результат анализа.

Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его.

Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом.

Какие биологические материалы исследуются

В исследовании обычно используются различные биоматериалы:

– Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин.

– Мокрота. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких.

– Биологические жидкости – околоплодная, спинномозговая, суставная и т.д.

– Соскобы со слизистых оболочек, например, носа или ротоглотки. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса.

– Кровь, сыворотка, плазма. Используются для определения вирусов ЦМВ (цитомегаловируса), ВИЧ, гепатитов B, C, D, G, герпеса, а также исследований человеческих генов.

– Биоптаты. Их забирают методом биопсии.

Преимущества и недостатки метода

ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно. Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется.

«Преимуществом метода является то, что можно определить возбудителя в малом количестве, просто в мизерном, – объяснил клинический фармаколог. – Благодаря этому можно быстрее поставить диагноз, потому что мы знаем, какой именно микроорганизм начинает развиваться.

В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество.

Мало, много, либо его вообще нет в организме».

По словам Андрея Кондрахина, к одному из минусов теста относятся сложности при заборе материала:

«Самый первый недостаток метода – необходима абсолютная чистота в помещении, ближе к стерильности, потому что попадание даже мельчайших инородных объектов может дать неправильный результат из-за того, что чувствительность аппарата очень высокая. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать.

Второе – чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры – кусочки, из которых будут создаваться новые РНК. Тест небыстрый – по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера.

Но чем больше машина, тем больше она может прочитать. Это система не для мобильного использования».

Загрязнение материала для теста может произойти также, если при его транспортировке были допущены ошибки, из-за непригодности реагентов, попадании в них крови, клеток эпителия, большого количества слизи.

Разновидности ПЦР

ПЦР-тест бывает нескольких видов:

– ПЦР с обратной транскрипцией. Его применяют для амплификации РНК.

  • – Инвертированная ПЦР используется, если для анализа есть маленький участок последовательности ДНК или РНК.
  • – Вложенная ПЦР нужна для уменьшения побочных реакций, для этого в амплификатор помещают два праймера.
  • – Количественная ПЦР применяется для наблюдения за изменением цепной реакции.
  • – Ступенчатая ПЦР позволяет снизить связывание праймеров.
  • Кроме этого, есть асимметричная ПЦР и групп-специфическая ПЦР.

«Существует методика проведения ПЦР в реальном времени, – рассказал Андрей Кондрахин. – Это самый быстрый анализ, как говорится, здесь и сейчас. Его делают при помощи прибора, в котором есть картридж, определяющий только одну инфекцию, например, коронавирус. Кроме него аппарат ничего не видит, как и при обычном ПЦР, однако в таком случае результат можно получить намного быстрее».

Какие инфекции позволяет выявить

  1. Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить у человека инфекционные заболевания, например:
  2. – гепатит;
  3. – уреаплазмоз половых органов;
  4. – кандидоз (молочница);
  5. – хламидиоз;
  6. – папилломавирусная инфекция;
  7. – герпес;
  8. – наличие раковых клеток;
  9. – микоплазмоз;
  10. – бактериальный вагиноз;
  11. – инфекционный мононуклеоз;
  12. – трихомониаз;
  13. – СПИД (ВИЧ).
  14. Также тестирование помогает выявить наследственную предрасположенность человека к некоторым заболеваниям и оценить гормональный фон.

ПЦР-тест на COVID-19

Для ПЦР-теста на коронавирус у человека берется мазок из носа и ротоглотки. Во время пандемии его рекомендуют сдать всем, кто болеет ОРВИ, гриппом, пневмонией и т.д.

Берут материал для анализа амбулаторно, также специалист может выехать на дом. Согласно требованиям, пациента выписывают после двух отрицательных тестов на наличие инфекции.

ПЦР-тесты могут давать ложноположительный или ложноотрицательный результат, в таком случае необходимо повторное исследование.

Как подготовиться к сдаче анализа

«Специальной подготовки вообще не требуется, разве что не принимать пищу за три часа (минимум) перед забором материала, если будут брать мазок из ротовой полости. Частички еды могут извратить результат. Достаточно прополоскать рот с водой и идти на анализ», – пояснил специалист.

Перед мазком также не рекомендуется пить кофе, чай, иные напитки, чистить зубы, полоскать рот освежающими смесями, жевать жевательную резинку, курить. Нос нельзя промывать, закапывать туда капли или мазать лекарствами.

Если берут кровь, то ее необходимо сдавать натощак, чтобы результат был максимально точным. Мочу следует собирать в утреннее время суток натощак или через 2-3 часа после приема пищи. Желательно сделать это сразу после сна.

Расшифровка анализа ПЦР

После проведения теста результаты оцениваются и аппаратурой, и специалистами-медиками.

«В конце теста машина сообщает, что она нашла в мазке, а врач-лаборант описывает результат, – объяснил эксперт. – Если в программу машины заложена информация о том, при каких количествах считается тест положительным, значит, это будет делать автомат. В анализе будет либо да, либо нет.

Читайте также:  Кардиолог в митино: прием врача в митино, вызов кардиолога на дом

Самому человеку ничего расшифровывать не нужно, единственное, что специалист может посмотреть за машиной – это количество кусочков РНК, потому что бывают ложноположительные или ложноотрицательные результаты, если в аппарате произошел сбой. Все равно контроль со стороны врача присутствует».

Насколько точна ПЦР-диагностика инфекций

«ПЦР абсолютно точна, практически 99,9%, потому что аппарат построит абсолютно такую же РНК, как слепок с ключа, один в один. Там ничего нового сделать нельзя. Набор частичек увеличивается до того количества, которое может распознать машина. Сделать это можно, даже если частиц очень мало», – отметил Андрей Кондрахин.

При этом из-за того, что зачастую встречаются ошибки при взятии биологического материала и существует вероятность попадания инородных частичек, могут возникать ложноположительные или ложноотрицательные результаты тестирования на коронавирус.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru

Интимный — 8 тестов по моче

[40-110] Интимный — 8 тестов по моче

2820 руб.

  • Комплексный анализ на основные инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), в ходе которого с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени определяется генетический материал (ДНК) микроорганизмов в моче.
  • Синонимы русские
  • Диагностика ИППП по моче.
  • Синонимы английские
  • Sexually transmitted diseases (STDs), Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), Urine.
  • Метод исследования
  • Реал-тайм ПЦР.
  • Какой биоматериал можно использовать для исследования?
  • Первую порцию утренней мочи.
  • Как правильно подготовиться к исследованию?
  • Мужчинам рекомендуется не мочиться и не проводить туалет половых органов в течение 6 часов до сбора мочи.

Общая информация об исследовании

Заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), – это объединенное название нескольких бактериальных, вирусных или протозойных инфекций (ИППП), которые могут приводить к воспалению различных отделов мочеполовой системы, в том числе уретриту, цервициту и простатиту. ЗППП имеют ряд общих черт:

  • общий путь передачи – половой; с клинической и эпидемиологической точки зрения это означает, что часто одному ЗППП сопутствует другое ЗППП, по этой причине целесообразно проводить скрининг всех ЗППП одновременно и при диагностике ЗППП у пациента рекомендуется обследовать всех его половых партнеров;
  • схожая клиническая картина — несмотря на то что ЗППП имеют отличительные особенности клинической картины, например гнойные выделения характерны для гонореи, слизистые и пенистые – для трихомониаза, особенностью бактериального вагиноза является резкий «рыбный» запах; эти клинические особенности, однако, не позволяют дифференцировать ЗППП между собой, единственный способ дифференцировать ЗППП – это методы лабораторной диагностики;
  • ЗППП часто протекают бессимптомно — так, около 50 % женщин с гонореей и около 50 % пациентов с хламидиозом (женщин и мужчин) не имеют никаких признаков инфекции, по этой причине скрининг на ЗППП целесообразно проводить всем сексуально активным пациентам, не использующим барьерный метод контрацепции, а не только пациентам с признаками ИППП.

Для диагностики ЗППП применяют несколько тестов. Хотя по-прежнему «золотым стандартом» диагностики ЗППП считается посев на питательную среду (культуральный метод), все большее применение находят методы молекулярной диагностики, а именно полимеразная цепная реакция в реальном времени (РТ-ПЦР).

РТ-ПЦР – это метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в моче) фрагменты генетического материала (ДНК) возбудителя инфекции.

РТ-ПЦР обладает значительными преимуществами по сравнению с другими методами идентификации ИППП, показывая более высокую чувствительность и специфичность.

Несмотря на то что при использовании РТ-ПЦР возможны ложноположительные и ложноотрицательные результаты, ее точность значительно превосходит точность бактериологического посева и других методов. Так, например, с помощью РТ-ПЦР можно выявить на 20-50 % больше случаев хламидиоза, чем при посеве.

Чувствительность ПЦР превосходит 90 %, это обусловлено тем, что для осуществления реакции теоретически достаточно всего одной молекулы ДНК (на практике – 10-1000 копий).

Такая высокая чувствительность позволяет использовать в качестве образца для анализа биологический материал с низкой концентрацией патогенов, например мочу. У мужчин результаты тестов на ИППП по моче, в том числе и РТ-ПЦР, отлично согласуются с результатами анализов тестов по уретральному мазку.

В отличие от уретрального мазка, мочу пациент может собрать самостоятельно, что значительно упрощает процесс диагностики и позволяет считать анализ мочи с помощью РТ-ПЦР самым лучшим тестом для диагностики ИППП у мужчин. Важно отметить, что у женщин ситуация несколько другая: наилучшим материалом для анализа с помощью РТ-ПЦР является мазок из влагалища или из шейки матки. Первую порцию мочи также можно использовать, но следует помнить, что анализ мочи выявляет примерно на 10 % меньше ИППП, чем анализ мазков.

Следует помнить об ограничениях метода РТ-ПЦР:

  • В реакции определяется ДНК как живых, так и разрушенных микроорганизмов. По этой причине метод РТ-ПЦР не используется для контроля лечения ЗППП. Результат исследования будет оставаться положительным еще в течение некоторого времени, даже если лечение было эффективно.
  • Обнаружение таких возбудителей, как N. gonorrhoeae, T. vaginalis и С. trachomatis – всегда патологический признак, требующий внимания врача. С другой стороны, положительный результат РТ-ПЦР на так называемые условно-патогенные микроорганизмы (Посев на Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum) при отсутствии признаков цервицита, уретрита и других клинических форм ЗППП не всегда позволяет утверждать о наличии клинически значимой инфекции. Результат анализа следует оценивать с учетом дополнительных клинических, лабораторных и инструментальных данных.
  • Точность РТ-ПЦР, хотя и в меньшей степени, чем других тестов, но все же зависит от применения антибиотиков. Использование цефалоспоринов (цефтриаксон), доксициклина, макролидов (азитромицин, эритромицин) может приводить к ложноотрицательному результату.

В данный комплексный анализ не включены тест на ВИЧ-инфекцию (скрининговым тестом для ВИЧ является ИФА, а не ПЦР), сифилис и вирусные гепатиты (скрининговым тестом для указанных инфекций являются серологические тесты, а не ПЦР).

Для чего используется исследование?

  • Для диагностики заболеваний, передающихся половым путем.

Когда назначается исследование?

  • При профилактическом обследовании сексуально активных пациентов, не использующих барьерный метод контрацепции;
  • при подозрении на уретрит, цервицит, простатит и другие воспалительные заболевания мочеполовой системы;
  • при диагностике ЗППП у сексуального партнера пациента.
  1. Что означают результаты?
  2. Референсные значения: отрицательно.
  3. Положительный результат:
  • одна или несколько инфекций, передающихся половым путем (ИППП).



Важные замечания

  • При диагностике ИППП точность исследования РТ-ПЦР мочи у женщин несколько уступает исследованию РТ-ПЦР уретрального или влагалищного мазка.
  • Также рекомендуется
  • [40-042] Интимный — оптимальный — анализ мазка у женщин
  • [40-043] Интимный — оптимальный — анализ мазка у мужчин
  • [40-118] Интимный — плюс — анализ мазка у женщин
  • [40-119] Интимный — максимальный — анализ мазка у женщин
  • [40-130] Интимный — плюс — для мужчин
  • [07-032] HIV 1,2 Ag/Ab Combo (определение антител к ВИЧ типов 1 и 2 и антигена p24)
  • [07-049] Treponema pallidum, антитела, сверхчувствительно
  • Кто назначает исследование?
  • Дерматовенеролог, уролог, гинеколог, врач общей практики.
  • Литература
  • Kim SJ, Lee DS, Lee SJ. The prevalence and clinical significance of urethritis and cervicitis in asymptomatic people by use of multiplex polymerase chain reaction. Korean J Urol. 2011 Oct;52(10):703-8.
  • Dong Q, Nelson DE, Toh E, Diao L, Gao X, Fortenberry JD, Van der Pol B. The microbial communities in male first catch urine are highly similar to those in paired urethral swab specimens. PLoS One. 2011;6(5):e19709.
  • Centers for Disease Control and Prevention. Recommendations for the laboratory-based detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae—2014. MMWR Recomm Rep. 2014 Mar 14;63(RR-02):1-19.

Сколько стоит сдать ПЦР-анализ

Я пять лет работал в государственной медицинской лаборатории.

По опыту знаю, что пациентам бывает непросто разобраться с тем, какие тесты им нужно сдавать, да и нужно ли вообще. В этой статье расскажу, что такое ПЦР-анализы и можно ли на них сэкономить.

Даниил Давыдов

разобрался с анализами

Профиль автора

Но генетические анализы нужны не так уж часто, поэтому в статье мы будем говорить про ПЦР-анализы на инфекции.

Как работает ПЦР-анализ. У большинства живых существ на нашей планете, за исключением некоторых вирусов с РНК-геномами, генетический материал представляет собой длинную двухцепочечную молекулу ДНК.

Для каждого микроорганизма набор реактивов нужен свой. Поэтому врачи назначают не ПЦР-анализ вообще, а исследование на конкретный микроорганизм. Так что ПЦР-тест на гепатит С не поможет найти в образце еще и хламидии.

ПЦР-анализы бывают качественные и количественные. Качественные позволяют понять, есть ли в образце генетический материал бактерии или вируса, который мы ищем. А количественные — сколько именно там этого материала. Если сделать несколько таких тестов во время лечения, станет ясно, действует ли на микробов назначенное лекарство.

Чтобы выяснить, какая инфекция поразила человека, у него обычно берут кровь, мочу, образцы клеток слизистой из ротоглотки или с шейки матки.

В России кровь по умолчанию рекомендуется сдавать натощак, не менее чем с интервалом в 8—12 часов после приема пищи.

Однако за рубежом таких строгих правил нет: считается, что перед походом в лабораторию можно позавтракать без сладкого и жирного, например кашей без сахара и масла, куриной грудкой или яйцом.

Так что если у вас был легкий завтрак, кровь сдавать можно. Пить тоже не запрещено, но лучше ограничиться чистой водой без газа.

Если врач назначил мазок из горла на ПЦР-анализ, за три часа до процедуры нельзя есть, чистить зубы, полоскать рот и рассасывать любые таблетки. Непосредственно перед взятием мазка не стоит жевать жевательную резинку. Если нос заложен, перед процедурой нужно как следует высморкаться.

Читайте также:  Травма зуба: ушибы, переломы

Правила, по которым нужно сдавать мазок на ПЦР из половых органов, отличаются для мужчин и для женщин.

Всем за 1—2 дня до исследования нужно отказаться от секса, а в течение 1,5—2 часов перед исследованием — воздерживаться от мочеиспускания.

Женщинам за сутки до процедуры не следует проводить спринцевание, пользоваться свечами и антисептиками для подмывания. Во время менструации сдавать биологический материал нельзя.

Ни один лабораторный тест не обеспечивает абсолютной точности, всегда есть вероятность ошибки. Причем ошибиться тест может в обе стороны: либо не найти искомую инфекцию у пациента, которой он на самом деле заражен, либо обнаружить ее у человека, болеющего чем-то другим или вовсе здорового.

Но здесь многое зависит от времени взятия образца. Если мазок из горла взяли через 3—4 дня после появления симптомов, то вирус уже мог успеть спуститься из ротоглотки в легкие, и тогда вероятность найти его в мазке составляет всего 40%.

Или не платить за лечение вообще. Расскажем в нашей рассылке вместе с другими материалами о деньгах

Проще всего разобраться с результатами качественных анализов: они могут быть либо положительными, либо отрицательными. Если результат положительный — значит, скорее всего, возбудитель в организме есть. Если отрицательный — скорее всего, его нет.

С результатами количественного ПЦР-анализа разобраться сложнее. Чтобы сказать, помогает ли лечение, нужно сделать несколько анализов — с интервалом от 2—3 дней до нескольких месяцев. Сравнивая старый и свежий результат, врач видит, что происходит с бактериями или вирусами в организме: становится ли их больше или, наоборот, меньше.

Если сделать всего один анализ, польза от количественного теста будет невелика: при положительном результате мы узнаем лишь то, что инфекция в организме действительно есть.

На этом бланке представлены результаты качественного и количественного теста на гепатит С — оба говорят, что вирус в организме есть. Через некоторое время после начала лечения нужно будет сделать повторный количественный анализ на гепатит С. Если концентрация вируса в биоматериале уменьшится, значит, лечение помогает. nuzdkp.ru

Это зависит и от конкретного микроорганизма, и от типа анализа, который вам нужно сдать. Например, возбудителя урогенитального микоплазмоза — бактерию Mycoplasma genitalium — можно обнаружить только методом ПЦР.

А возбудителя хламидиоза — Chlamydia trachomatis — удастся найти еще и методами иммуноферментного анализа (ИФА), прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) и культуральным посевом (КП).

Иногда анализ, проведенный другим методом, обходится дешевле, но может либо занять больше времени, либо оказаться менее точным.

Что касается количественных анализов, то в большинстве случаев имеет смысл сдать именно тот тест, который рекомендует врач. От точности количественного анализа зачастую зависит результат лечения.

Если нужный вам анализ есть в стандарте лечения заболевания, а само заболевание входит в базовую — действующую по всей стране — или в территориальную программу ОМС, то этот анализ вам должны сделать бесплатно. Но на практике возможны нюансы.

Цена ПЦР-анализа зависит от нескольких параметров.

Методики ПЦР, которую применяют в конкретной лаборатории. Например, в LabQuest для качественного определения вируса гепатита С применяют ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) — это стоит 2780 Р. А в List Lab используют классический ПЦР-тест  за 520 Р.

ПЦР в реальном времени предназначена для количественных тестов, но ее можно применять и для качественных анализов — правда, получится дороже, а разницы с более дешевым классическим вариантом ПЦР не будет.

Количества анализов, которые вы собираетесь сдавать. Например, в лаборатории «Инвитро» выявление возбудителей ИППП 7 типов методом ПЦР в мазке обойдется в 3100 Р, а определение одних только хламидий — в 835 Р.

Вида микроорганизма, который нужно обнаружить. Например, в лаборатории LabQuest анализ на коронавирусную инфекцию обойдется в 2500 Р, а анализ на возбудителя гонореи — в 360 Р.

Чтобы сравнить цены в разных клиниках, мы выбрали один анализ — на гепатит С, для которого берут кровь из вены. Цены указаны с учетом взятия крови.

  1. ПЦР-тесты помогают обнаружить фрагменты генетического материала бактерий, вирусов или других людей. Но для каждого микроорганизма реактив нужен свой, так что универсальных тестов ПЦР на все инфекции сразу не бывает.
  2. Подготовка к анализу зависит от того, какой биологический материал вы сдаете. Если кровь, то особо готовиться не надо. Для других материалов есть несложные правила — если их соблюдать, анализ будет точнее.
  3. Если вам назначили качественный ПЦР-анализ, имеет смысл сдавать его или в государственной лаборатории (если обследование положено по ОМС), или в частной, где окажутся подходящие цены.
  4. Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ. Если указания на метод нет — выбирайте ту лабораторию, цены в которой вас устраивают.

ПЦР-диагностика

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки.

Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.

Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» — ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам.

Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК.

Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК. Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий.

После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) — уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя.

И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз. И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата. Амплификация (увеличение числа копий ДНК) Важнейший этап исследования.

Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация. Денатурация Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы.

Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C. Отжиг Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами — изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот.

Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.

Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот. Такой температурный цикл проводится 30 и более раз.

В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).

Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

  1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
  2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
  3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.
Читайте также:  УЗИ почек на дому: вызов УЗИ почек на дом в Москве, цены на услуги

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки. Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.

Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.

Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др. Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.).

А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию. Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ.

Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа. В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.

Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов. Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка.

Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого. Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

пцр диагностика на Инфекции:

ПЦР на ВИЧ ПЦР на Вирусные гепатиты

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (англ. — PCR — polymerase chain reaction) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.

О методе пцр

ПЦР — это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (ДНК) инфекционного возбудителя и многократно размножить его.

Другие методы диагностики половых инфекций

В диагностике инфекций передаваемых половым путем (ИППП) также используются следующие методики:

  • микроскопия — исследование неокрашенных и окрашенных препаратов в светооптическом микроскопе. Точность метода зависит от опыта врача-лаборанта. Как правило хорошо диагностируются гонококки, трихомонады, гарднереллы и кандиды (бактерии больших размеров). Другие инфекции не видны под микроскопом, так как очень маленького размера.
  • бактериология — культивирование (выращивание) инфекций на питательных средах. До практического использования ПЦР, бактериальное исследование считалось «золотым стандартом» в диагностике ИППП, т. е. самым точным методом. Большим плюсом данной методики является возможность определения чувствительности микробов к антибиотикам. Минусом — необходимость быстрой доставки клинического материала в лабораторию, пока микробы не погибли в окружающей среде, не все ИППП растут на питательных средах, необходимость использования качественных питательных сред, сроки получения результатов — 5 — 7 дней.
  • иммуноферментный анализ — определение специфических антител (белков), вырабатываемых в ответ на внедрение микробов (антигенов) в сыворотке крови. То есть выявляют не сам микроб, а антитела которые вырабатывает организме человека. Плюсом метода является возможность определение стадии инфекционного процесса (в острой стадии определяются иммуноглобулины (антитела) класса М, в хронической — иммуноглобулины класса G). Минусом — отсутствие выработки антител у пациентов с иммунодефицитом, перекрестная реакция антител со схожими микробами, низкие показатели чувствительности и специфичности. На основании результатов только ИФА без подтверждения другими методами диагностики и при отсутствии клинических проявлений выставлять диагноз не представляется возможным.

О точности метода пцр при диагностике инфекций

В настоящее время ПЦР является самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний. Точность любого метода диагностики в медицине оценивается такими понятиями как чувствительность и специфичность. Чувствительность — процент положительных результатов среди обследованных инфицированных лиц.

Это значит, что при обследовании 100 человек больных хламидиозом методом ПЦР диагноз будет подтвержден у 98-99 человек, а у 1-2 человек из 100 будет установлен ложноотрицательный результат. Чувствительность ИФА в диагностике инфекций передаваемых половым путем — 50-60%. Это значит, что у 40-50 людей из 100 больных хламидиозом возможен ложноотрицательный результат.

Специфичность — процент отрицательных результатов среди обследованных здоровых лиц. Это значит , что при обследовании 100 здоровых людей на хламидии методом ПЦР у 97-98 обследуемых покажет отрицательный результат, а у 2-3 человек возможен ложноположительный результат. Специфичность ИФА составляет 60-70%.

  Ниже приведены показатели чувствительности и специфичности методов диагностики инфекций передаваемых половым путем.

Метод диагностики Чувствительность, % Специфичность, %
Микроскопия 20 — 60 70 — 80
Бактероилогия 40 — 80 80 — 90
ИФА -серология 50 — 60 60 — 70
ПЦР 98 — 99 97 — 98

Как видно из таблицы метод ПЦР обладает наилучшими результатами в диагностике инфекции передаваемых половым путем. Именно поэтому можно получить разные результаты исследования у одного человека, если он обследован разными методами диагностики. Но приоритет всегда должен отдаваться ПЦР, как самому точному из всех. 

О двух методиках пцр-анализа

На сегодняшний день существует 2 методики ПЦР-анализа: так называемая «форезная» и «ПЦР в реальном времени» (более современная).

Основным приемуществом методики ПЦР в реальном времени по сравнению с форезом является:

  • сведение к минимуму риска контаминации (загрязнение) лаборатории и связанных с ней ложно-положительных результатов и артефактов ПЦР-анализа
  • упрощение требований к организации лаборатории — отсутствует необходимость в изолированном дополнительном помещении для проведения этапа детекции и отдельного врача -лаборанта
  • автоматический анализ результатов с помощью компьютера, стандартизация результатов, исключение субъективности результатов (при форезной методике результат исследования определяется врачем-лаборантом, а при ПЦР в реальном времени — компьютером)
  • возможность количественной оценки содержания ДНК возбудителя в клиническом образце

От чего зависит, что показывает ПРЦ-тест?

Несмотря на высокую точность анализов, не редки случаи получения противоположных результатов в разных ПЦР-лабораториях. Это объясняется многими факторами. Критериями качественной работы лаборатории является:

  • использование сертифицированных тест — систем, обладающих высокой аналитической чувствительностью
  • использование внутренних и внешних контролей работы лаборатории
  • высокая воспроизводимость результатов (95 — 98%)
  • современное оборудование
  • квалифицированные специалисты
  • борьба с контаминацией (загрязнением лаборатории продуктами амплификации)
  • правильное расположение «рабочих» зон лаборатории
  • при наличии сомнительных результатов и артефактов ПЦР-анализа — их перестановка на различных этапах
  • архивирование результатов исследований с возможностью их просмотра в спорных случаях.

Таким образом, только сочетание грамотного специалиста и качественно работающей лаборатории могут обеспечить постановку правильного диагноза и как следствие быстрого и полного выздоровления.

Если возникает несоответствие клинической картины с результатами лабораторных исследований, необходимо повторное проведение анализов.

Единственное нужно понимать, что подтвердить диагноз, поставленный методом ПЦР, можно только методом ПЦР, выполненным в другой лаборатории или повторно в этой же, так как другие способы диагностики сильно уступают вышеуказанному методу диагностике.

Если вы хотите сдать ПЦР-анализы и получить профессиональную диагностику, то специалисты нашей клиники готовы оказать вам действительно качественные услуги.

Оставьте комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Adblock
detector